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021-54888888/15800441009
产品及特点：
1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据苹果锈果类病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 基于染料法qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR高10-100 倍，可以达到至少1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 qRT-PCR技术，RT和PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够50次30μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。
规格及成分：
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编号 |
成分 |
规格 |
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试剂一 |
2×qRT-PCR 缓冲液 |
500 μL(棕色管) |
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试剂二 |
10×qRT-PCR 酶混合液 |
100 μL(红盖) |
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试剂三 |
ROX 染料 I，50× |
20 μL(棕色管) |
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试剂四 |
ROX 染料 II，50× |
20 μL(棕色管) |
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试剂五 |
荧光 PCR 专用模板稀释液 |
1mL(黄盖) |
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试剂六 |
苹果锈果类病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液 |
100 μL(白盖) |
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试剂七 |
苹果锈果类病毒染料法 qRT-PCR 阳性对照 (1×10E8 /μL) |
50 μL(黄盖) |
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试剂八 |
沙核酸释放剂(试用装) |
20 次(1mL，绿盖) |
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试剂九 |
使用手册 |
1 份 |
低温运输、-20℃保存，有效期一年。
阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 DNA 片段作为阳性对照。
自备试剂：
样品 RNA。
使用方法：
一、稀释阳性对照：
以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例，由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
2. 在7号管中加入 5μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3. 换枪头，在 6 号管中加入5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
4. 换枪头，在 5号管中加入5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备：
5. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提�。喑龅囊桓鍪� PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。
三、设置RT-PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）：
7. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记 N+9个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1 个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成 1个，其余不变。
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
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成分 |
N+2个制备 所得样品 |
qRT-PCR 阴性对照 |
qRT-PCR阳性对照(2-7管) |
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2×qRT-PCR缓冲液 |
10μL |
10μL |
各10μL |
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苹果锈果类病毒染料法qRT-PCR引物混合物 |
2μL |
2μL |
各2μL |
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50×ROX (见注) |
0.4μL |
0.4μL |
各0.4μL |
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样品制备所得RNA 模板(来于第8步) |
5.6μL |
-- |
-- |
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稀释所得6个阳性对照 (来于第6步) |
-- |
-- |
各5.6μL2号样到2号 管,3号样到3号管 |
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超纯水 |
-- |
5.6μL |
-- |
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10×qRT-PCR酶混合液 |
2μL |
2μL |
2μL |
需使用 ROX 染料 II 的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程
温度
时间
RT（逆转录）
50℃
15-30 min
预变性
95℃
5 min
Qrt-PCR反应40个循环
95℃
15 sec
58℃
1 min,（采集FAM通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行溶解曲线分析
四、数据处理：
11. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
五、特别提示：
本公司的所有产品，仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
