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产品及特点：
BK病毒(BKVirus、BKV)是在一位肾移植后出现肾功能衰竭伴输尿管狭窄患者的尿液样本中首次分离得到的一种新型的病毒,随着器官移植术的广泛开展及强效免疫抑制剂的使用,BK感染已成为肾脏移植后功能丧失及骨髓移植后急性肾功能衰竭的重要原因。
BKV原发感染多集中在婴幼儿时期,通常无明显的临床症状,或表现为发热、轻微呼吸道感染症状，对人体的肾功能有巨大�：Γ虼薆K病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的BK病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒。
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据BK病毒(BKVirus、BKV)保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
规格及成分：
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编号 |
成分 |
规格 |
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试剂一 |
2×qPCRMagicMix |
500μL(棕色管) |
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试剂二 |
荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL(黄盖) |
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试剂三 |
BK病毒(BKVirus、BKV)染料法PCR引物混合液 |
100μL(白盖) |
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试剂四 |
BK病毒(BKVirus、BKV)染料法PCR阳性对照(1×10E8/μL) |
50μL(红盖) |
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试剂五 |
DNA病毒裂解液(试用装) |
15次(9mL) |
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使用手册 |
1份 |
低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。
使用方法：
一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)：
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
4. 在7号管中加入5μL1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备：
8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提�。喑龅囊桓鍪荘C(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。
三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)：
10. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
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成分 |
样品管 N+2个 |
PCR阴性对照管 |
PCR阳性对照管(2-7管) |
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2×qPCR MagicMix(棕色管) |
10μL |
10μL |
各10μL |
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BK病毒(BKVirus、BKV)PCR引物混合液(白盖） |
2μL |
2μL |
各2μL |
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自备10×ROX(见注) |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2待测样品DNA模板 |
6μL |
不加 |
不加 |
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第7步所得PCR阳性对照稀释液(2-7号) |
不加 |
不加 |
各6μL2号样到2号管,3号样到3号管 |
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
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过程 |
温度 |
时间 |
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预变性 |
92℃ |
5分钟 |
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PCR反应30个循环 |
94℃ |
60秒 |
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50℃ |
60秒 |
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72℃ |
60秒 |
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理：
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
五、特别提示：
本公司的所有产品，仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
