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产品及特点
生物制品中的非目标DNA 残留作为工艺相关杂质，具有一定的风险性，包括致瘤性、感染性以及免疫原性等。腺相关病毒 (Adeno－Associated Virus，AAV) 由于自身高稳定性及安全性、低免疫原性等特点在基因治疗领域备得到广泛的用于，目前市面上 基因治疗用AAV大多数为重组腺相关病毒 ( Recombinat Adeno-Associated Virus，rAAV) 载体，相关指导原则中明确指出应当在质量监控环节加以监控，因此检测重组腺相关病毒残留DNA具有重要的意义，为此本公司基于荧光定量PCR技术，开发了专门用于检测样品中重组腺相关病毒残留DNA的本产品，它具有下列特点：
生物制品中的非目标DNA 残留作为工艺相关杂质，具有一定的风险性，包括致瘤性、感染性以及免疫原性等。腺相关病毒 (Adeno－Associated Virus，AAV) 由于自身高稳定性及安全性、低免疫原性等特点在基因治疗领域备得到广泛的用于，目前市面上 基因治疗用AAV大多数为重组腺相关病毒 ( Recombinat Adeno-Associated Virus，rAAV) 载体，相关指导原则中明确指出应当在质量监控环节加以监控，因此检测重组腺相关病毒残留DNA具有重要的意义，为此本公司基于荧光定量PCR技术，开发了专门用于检测样品中重组腺相关病毒残留DNA的本产品，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到0.001 pg/μL。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物和探针是根据重组腺相关病毒DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL |
1.5mL绿色盖 |
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超纯水 |
1mL |
1.5mL蓝色盖 |
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重组腺相关病毒残留qPCR引物-探针干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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重组腺相关病毒残留qPCR阳性对照(100 pg/μL) |
50μL |
0.5mL黄色盖 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162 μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀释标准曲线样品以100 pg-0.001 pg/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6、5、4，3、2、1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3. 在6号管中加入5 μL 1×100 pg/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10 pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10 pg/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1 pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1pg/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得100 ng/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到从100 pg/μL 到1 ng/μL 共6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
样品DNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提�。喑龅囊桓鍪荘C（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的其实样本体积相同。NC可以用水替代。本试剂盒跟市场上大多数核酸纯化试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qPCR反应20 μL体系，在样品制备室进行
8. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
2. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
自备试剂
样品DNA
样品DNA
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年
低温运输，-20℃保存，有效期2年
