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产品及特点
马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus），也叫密执安棒形杆菌环腐亚种，是一种杆状，无鞭毛的革兰氏阳性菌，菌体大小为0.4～0.6 μm×0.8～1.2 μm。马铃薯环腐病菌会在马铃薯生长季节后期和结薯期侵染其叶片，从而导致马铃薯环腐病。该病是一种维管束病害，主要分布我国在华北地区。其特有的症状是通过挤压横切的病薯，维管束环外围的组织很容易和内部的分开，同时流出乳白色至奶酪状无气味的菌脓，内部的离析组织一起被排出。但约有60％感染了马铃薯环腐病的块茎，不显症状或症状轻微，通过种薯切刀后肉眼观察很难发现。另外，若该病发生在马铃薯植株生长期，其症状会与马铃薯青枯病相似，不易区分。伴随着我国各地种薯调运，该病的感染已遍及全国各马铃薯产区，导致发病率高的地块大幅度减产。在种薯贮藏期间，该病也会持续产生�：Γ现厥钡贾侣砹迨砜榫ジ茫蠓档推渚眉壑�。因此对马铃薯环腐病菌进行快速、准确检测具有重要的意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测马铃薯环腐病菌的试剂盒，它具有下列特点：
马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus），也叫密执安棒形杆菌环腐亚种，是一种杆状，无鞭毛的革兰氏阳性菌，菌体大小为0.4～0.6 μm×0.8～1.2 μm。马铃薯环腐病菌会在马铃薯生长季节后期和结薯期侵染其叶片，从而导致马铃薯环腐病。该病是一种维管束病害，主要分布我国在华北地区。其特有的症状是通过挤压横切的病薯，维管束环外围的组织很容易和内部的分开，同时流出乳白色至奶酪状无气味的菌脓，内部的离析组织一起被排出。但约有60％感染了马铃薯环腐病的块茎，不显症状或症状轻微，通过种薯切刀后肉眼观察很难发现。另外，若该病发生在马铃薯植株生长期，其症状会与马铃薯青枯病相似，不易区分。伴随着我国各地种薯调运，该病的感染已遍及全国各马铃薯产区，导致发病率高的地块大幅度减产。在种薯贮藏期间，该病也会持续产生�：Γ现厥钡贾侣砹迨砜榫ジ茫蠓档推渚眉壑�。因此对马铃薯环腐病菌进行快速、准确检测具有重要的意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测马铃薯环腐病菌的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据马铃薯环腐病菌DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL |
1.5mL绿盖管 |
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超纯水 |
1mL |
1.5mL蓝盖管 |
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马铃薯环腐病菌qPCR引物-探针干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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马铃薯环腐病菌阳性对照(1×10E7拷贝/μL) |
50μL |
0.5mL黄盖管 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3. 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
样品DNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提�。喑龅囊桓鍪荘C（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qPCR反应20μL体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
2. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。15. 阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。15. 阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
自备试剂
样品DNA
样品DNA
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期1年
低温运输，-20℃保存，有效期1年
