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产品及特点
立克次体 (Rickettsias) 是一大类专性真核细胞内寄生的原核微生物，常呈多形性，革兰氏阴性。多种立克次体是重要的人兽共患病原体，可通过媒介昆虫的叮咬和排泄物、或气溶胶进行传播，广泛分布于世界各地。常见的立克次体疾病主要有斑疹伤寒、斑点热、恙虫病、Q热，其对应的病原体分别为斑疹伤寒群立克次体 (Typhus Group Rickettsiae，TGＲ)、斑点热群立克次体(Spotted Fever Group Rickettsiae，SFGR) 、恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot) 和贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii，Cb) 。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测上述四种之一的斑点热群立克次体通用的试剂盒，它具有下列特点：
立克次体 (Rickettsias) 是一大类专性真核细胞内寄生的原核微生物，常呈多形性，革兰氏阴性。多种立克次体是重要的人兽共患病原体，可通过媒介昆虫的叮咬和排泄物、或气溶胶进行传播，广泛分布于世界各地。常见的立克次体疾病主要有斑疹伤寒、斑点热、恙虫病、Q热，其对应的病原体分别为斑疹伤寒群立克次体 (Typhus Group Rickettsiae，TGＲ)、斑点热群立克次体(Spotted Fever Group Rickettsiae，SFGR) 、恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot) 和贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii，Cb) 。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测上述四种之一的斑点热群立克次体通用的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到100拷贝/反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据斑点热群立克次氏体DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5. in silico分析发现本产品可以检测R.rickettsii、R.heilongjiangensis、R.sibirica、R.raoultii、R.conori和R.montana这些属于SFGR的立克次氏体。
6. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
7. 本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
8. 本产品只能用于科研。
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL |
1.5mL绿盖管 |
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超纯水 |
1mL |
1.5mL蓝盖管 |
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斑点热群立克次氏体qPCR引物-探针干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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斑点热群立克次氏体qPCR阳性对照(1E7拷贝/μL) |
50μL |
0.5mL黄盖管 |
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使用手册 |
1份 |
1份 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165 mL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3. 在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
样品DNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提�。喑龅囊桓鍪荘C（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qPCR反应20 μL体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
2. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。15. 阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
自备试剂
样品DNA
样品DNA
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年
低温运输，-20℃保存，有效期2年
