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GMO外源pat基因探针法qPCR试剂盒
产品及特点
用PCR筛查转基因植物的时候，通常选择外源启动子、外源功能基因或外源终止子等GMO元件作为靶分子。如果待测样本中有上述靶分子存在，就可以初步断定该样本中有转基因成分。来于绿产色链霉球菌（S.viridochromogenes）的pat（phosphinthricin acetyltransferase，膦丝菌素乙酰转移酶）基因就是常用的GMO外源功能基因，该基因并不存在于天然的植物细胞中。该酶可以使草铵膦乙酰化而失活，因而它能赋予转基因植物对除草剂草丁膦的耐受性。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门筛查GMO材料中外源pat基因的试剂盒，它具有下列特点：
产品及特点
用PCR筛查转基因植物的时候，通常选择外源启动子、外源功能基因或外源终止子等GMO元件作为靶分子。如果待测样本中有上述靶分子存在，就可以初步断定该样本中有转基因成分。来于绿产色链霉球菌（S.viridochromogenes）的pat（phosphinthricin acetyltransferase，膦丝菌素乙酰转移酶）基因就是常用的GMO外源功能基因，该基因并不存在于天然的植物细胞中。该酶可以使草铵膦乙酰化而失活，因而它能赋予转基因植物对除草剂草丁膦的耐受性。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门筛查GMO材料中外源pat基因的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供DNA样品。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/μL。
3. 特异性高，根据GMO外源pat基因保守区域设计引物和探针，不会跟其他基因发生交叉反应。
4. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
5. 所用探针为FAM标记，可以跟其他荧光标记的GMO PCR检测组合成多重检测。
6. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅2小时。
7. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
8. 本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光定量PCR。
9. 本产品只可用于科研。
规格及成分
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL |
1.5mL绿盖管 |
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GMO外源pat基因探针法qPCR引物-探针混合干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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GMO外源pat基因探针法qPCR阳性对照（1E7拷贝/μL） |
50μL |
0.5mL黄盖管 |
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超纯水 |
1mL |
1.5mL蓝盖管 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀释标准曲线样品以阳性对照1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度和内参固定在1E3拷贝/μL为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。
稀释标准曲线样品以阳性对照1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度和内参固定在1E3拷贝/μL为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3. 在6号管中加入5 μL阳性对照（浓度为1×1E7拷贝/μL，本试剂盒提供），充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡1分钟，得 1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
样品DNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的样本起始体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提�。喑龅囊桓鲇米餮分票秆粜远哉展�、另一个用作样品制备阴性对照管。
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qPCR反应20 μL 体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第一步稀释得到的标准曲线系列稀释液的第3号做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
2. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以FAM通道的Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的FAM通道的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须没有读数，或者大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，FAM通道的Ct值应该小于40。对待测样品，如果其FAM通道的Ct没有读数、大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。
自备试剂
样品DNA
样品DNA
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年
低温运输，-20℃保存，有效期2年
