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品质保证 · 通蔚试剂
021-54845833/15800441009品质保证 · 通蔚试剂
发布时间：2024-01-02 发布作者：上海通蔚生物
酶联免疫吸附测定 ( ELISA ) 由 Engvall 和 Perlmann (1971)首次提出，最初用于检测免疫球蛋白 G。这种免疫测定是对当时常见的放射免疫测定的一个可喜的变化，后者利用放射性标记的抗体和抗原。ELISA 的发展基于 20 世纪 60 年代的观察，即抗体或抗原可以吸附到固体表面并仍然参与高亲和力结合。术语 ELISA 现在指的是多种免疫测定法，其中一些不涉及酶促反应。然而，所有 ELISA 的共同点是使用抗体，抗体在确定测定的灵敏度和特异性方面发挥着重要作用。
ELISA 用于生物医学研究和发现的多个领域以及诊断目的。进行 ELISA 的方法有很多种，确定哪一种方法最适合解决您的特定研究问题取决于多种因素，包括所需的灵敏度或检测的具体内容。在这里，上海通蔚生物描述了不同类型的 ELISA，重点介绍每种类型的优点和缺点，以及选择 ELISA 技术之前应考虑的事项。
有四种 ELISA 技术可应用于您的研究。选择合适的抗体取决于可用的抗体、所需的结果以及样品的复杂性。ELISA 技术包括：直接 ELISA、间接 ELISA、夹心 ELISA 和竞争或抑制 ELISA。
图 1 展示了直接 ELISA 的典型设置。通常，抗原被固定至多孔板。然后通过直接与辣根过氧化物酶 (HRP) 等酶缀合的抗体检测抗原。
图1 直接elisa
优点：
1. 由于所需步骤较少，因此比其他 ELISA 技术快得多。
2. 由于所需试剂和步骤较少，因此测定不易出错。
缺点：
1. 由于固定抗原的方法不具有特异性，这可能会导致比间接 ELISA 更高的背景噪音（如下所述）。这主要是因为样品中的所有蛋白质（包括目标蛋白质）都会与板结合。
2. 灵活性较差，因为每种靶蛋白都需要特定的缀合一抗。
3. 无信号放大，降低了测定灵敏度。
直接ELISA应用范围：
当需要分析针对抗原的免疫反应时，通常使用直接 ELISA 技术。
在该 ELISA 技术中，分两步检测固定在多孔板上的抗原。首先，未标记的一抗（通常是单克隆）结合特定抗原。其次，应用针对一抗宿主物种的酶联二抗（通常是多克�。�。
图2 间接elisa
优点：
1. 灵敏度高，因为多个标记的二抗可以结合一抗。
2.经济，因为需要更少的标记抗体。
3. 具有灵活性，因为不同的一抗可以与单一标记的二抗一起使用。
缺点：
1. 由于使用二抗而可能发生交叉反应，这可能会增加背景噪音。
2. 由于需要与二抗孵育步骤，因此比直接 ELISA 技术的程序更长。
间接ELISA应用范围:
间接 ELISA 技术适用于测定样品中的总抗体浓度。
夹心 ELISA 需要使用匹配的抗体对（捕获抗体和检测抗体）。因此，每种抗体对抗原的不同且不重叠的区域或表位具有特异性。重要的是，在 ELISA 中专门测试匹配的抗体对，以确保它们检测到不同的表位，从而获得准确的结果。夹心 ELISA 的程序包括用捕获抗体涂覆聚苯乙烯板。然后添加分析物或样品，然后添加检测抗体。检测抗体可以是酶联的，在这种情况下，这被称为直接夹心 ELISA。如果使用的检测抗体未标记，则需要酶联检测二抗。这称为间接夹心 ELISA。
单克隆和多克隆抗体均可用于夹心 ELISA。然而，多克隆抗体通常用作捕获抗体，以尽可能捕获最大量的抗原。
图3 夹心elisa
优点：
1、灵敏度高；其灵敏度比直接或间接 ELISA 高 2-5 倍。
2.使用两种抗体，特异性高。
3. 提供灵活性，因为可以使用直接和间接方法。
缺点：
如果不使用标准化 ELISA 试剂盒或经过测试的抗体对，抗体优化可能会很困难，因为减少捕获抗体和检测抗体之间的交叉反应非常重要。
夹心ELISA应用范围：
夹心 ELISA特别适合分析复杂样品，因为在使用这种方法进行测量之前不需要纯化抗原。
竞争/抑制 ELISA，也称为封闭 ELISA，可能是所有 ELISA 技术中最复杂的。然而，上述每种测定类型都可以适应竞争形式。竞争/抑制 ELISA 主要用于通过检测预期信号输出中的干扰来测量样品中抗原或抗体的浓度。本质上，样品抗原或抗体与参考分别竞争结合有限量的标记抗体或抗原。样品抗原浓度越高，输出信号越弱，表明信号输出与样品中抗原的量成反比。
图4 竞争ELISA
图 4 显示了基于直接检测方法的竞争 ELISA 测试抗原的示例。在此示例中，使用已知抗原包被多孔板。按照标准封闭和洗涤步骤，添加含有未知抗原的样品。然后使用标记的检测抗体使用相关底物（例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺或TMB）进行检测。如果样品中抗原浓度高，则会观察到信号输出显着减少。相反，如果样品中的抗原非常少，则预期信号输出将几乎没有减少。在图 4 所示的示例中，信号输出将会减少。
优点：
1. 竞争性ELISA的主要优点是无需样品处理，可以使用粗制或不纯的样品。
2. 与夹心 ELISA 相比，对样品稀释和样品基质效应的敏感性较低。
3. 重复样品之间和测定之间的变异性较小。
4. 实验设置具有最大的灵活性，因为它可以基于直接、间接或夹心 ELISA。
缺点：
由于每种 ELISA 技术都可以适应竞争性形式，因此上述每种 ELISA 技术所描述的相同限制将适用于相应的竞争性/抑制 ELISA 技术。
当只有一种抗体可用于感兴趣的抗原时，通常使用竞争/抑制 ELISA 技术。它还适用于检测不能被两种不同抗体结合的小抗原，例如夹心 ELISA 技术。
如上所述，有许多因素决定哪种 ELISA 技术适合解决您的研究问题。在决定哪一个适合您之前需要考虑以下几个问题:
您需要检测什么？
例如，如果检测具有多个表位的大蛋白（例如细胞因子），则夹心 ELISA 将是最合适的。然而，如果检测到半抗原等小分子，那么在这种情况下竞争性 ELISA 会更合适。
有哪些试剂可用于您感兴趣的抗原或抗体
如果只有一种抗体可用于感兴趣的抗原，则可以应用直接或竞争性 ELISA。
您想测量免疫反应或分析物吗？
如果您需要检测或定量分析物，则可以使用夹心法或竞争性 ELISA。然而，如果您需要测量免疫反应，那么直接或间接 ELISA 最适合您的需求。