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品质保证 · 通蔚试剂
021-54845833/15800441009品质保证 · 通蔚试剂
发布时间：2024-08-12 发布作者：上海通蔚生物
在现代生物技术中，酶联免疫吸附试验 (ELISA) 被广泛用于确定生物样品中抗原、抗体、肽、蛋白质、激素或其他生物分子的存在和数量。由于其灵敏度高，它可以识别出甚至最小的抗原浓度。
ELISA 的敏感性归因于其识别单个抗原抗体复合物之间相互作用的能力。
Elisa 试剂盒在不断变化的医学研究和诊断领域 中至关重要。由于其卓越的准确性和适应性，这些试剂盒对于解决医学难题和研究新疗法至关重要。随着科学好奇心和技术进步，它们的用途已扩展到从传染病到癌症生物标志物识别等各个领域。它们每天都在开辟新天地，帮助改善患者护理并实现革命性的医学进步。
“酶联免疫吸附测定法”或简称“ELISA”于 1971 年首次使用，指用于测量抗原浓度的酶基免疫测定技术。酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒用于研究检测和量化样本内的特定蛋白质序列和其他靶标。使用正确的ELISA 试剂盒 可提供精确、可量化的数据，以确认和支持您的研究。在科研实验项目选择适当的试剂盒类型（直接、间接、夹心或竞争性 ELISA）。高质量的ELISA试剂盒经过精心设计，能够容忍一定的技术差异，并帮助您获得更准确、可靠的实验结果。
ELISA 技术包括多种免疫测定方法，不同的方法在具体步骤和应用场景上有所差异。几种关键参数，例如要检测的抗原类型、针对特定抗原的单克隆抗体以及必要的测试灵敏度，决定了应采用哪种类型的 ELISA。夹心 ELISA 由于具有高灵敏度和特异性，在细胞因子检测中应用广泛。间接ELISA 也是常用的方法之一。
1. 夹心 ELISA
细胞因子夹心 ELISA 是一种灵敏的酶联免疫测定法，可以精确识别和测量可溶性趋化因子和细胞因子蛋白的量。基本细胞因子夹心 ELISA 方法使用高纯度的抗细胞因子抗体（捕获抗体）。这些抗体非共价吸附在塑料微孔板上。固定化抗体可选择性地结合洗板后加入板中的样品中的可溶性细胞因子蛋白。
去除未结合的物质后，使用生物素偶联的抗细胞因子抗体（检测抗体）来识别已收集的细胞因子蛋白。随后是酶标记的亲和素或链霉亲和素步骤。
ELISA 读数仪 可 用于在添加显色底物后，以可接受的光密度 (OD) 分光光度法简单地量化结合的酶联检测试剂产生的有色产物的量。当板读数仪与计算机连接时，数据存储和重新分析变得更加容易。
ELISA 夹心法 是测量分析物时获得高精度的首选方法。这种方法可以揭示分析物的特异性和灵敏度，首先使用捕获抗体固定分析物。当添加带有酶标记的检测抗体时，夹心结构就像积木一样组装起来。它通过识别分析物上的另一个表位来完成复杂的夹心结构。
2. 间接 ELISA
间接 ELISA 是一种利用二抗识别一抗抗原特异性抗体的方法。间接ELISA中，二抗的标记酶和二抗的亲和力可以影响灵敏度和信号放大。两种抗体在这种配置下共同作用，增强信号并提高灵敏度，使分析物更容易被检测到。
一抗具有高特异性，可以特异性识别分析物，并与之形成牢固的结合。然后，二抗通过其与一抗的结合位点特异性识别并结合到一抗上。二抗通常被标记上酶，例如辣根过氧化物酶（HRP），当加入底物时，酶会催化底物反应，产生颜色变化或化学发光信号，从而实现分析物的检测。
间接ELISA在检测细胞因子时灵敏度通常较高，这主要是因为二抗的标记酶可以放大信号，从而提高检测灵敏度。间接ELISA的灵敏度取决于多种因素，包括一抗的亲和力和特异性、二抗的亲和力和标记酶的活性、底物的敏感性和稳定性以及实验操作的规范性。
此外，一种酶偶联的二抗可以识别来自同一物种的多种一抗。这为用户提供了根据需要在检测不同抗原的几种ELISA中使用相同的酶偶联二抗的选择，但前提是这些抗原来自同一物种，并且二抗能够识别这些抗原。相关阅读：《elisa试剂盒有哪几种类型？elisa四类型图解》
考虑以下几点将有助于您的 ELISA 试剂盒发挥最佳作用：
1.抗体的特异性
ELISA 测试中抗体的选择 取决于特异性和亲和力标准。根据定义，单克隆抗体结合更精确，可降低背景信号。多克隆抗体和单克隆抗体可以一起使用或单独使用。虽然多克隆抗体会产生更高的信号，但非特异性结合也会更普遍。每次还需要进行广泛的测试，因为多克隆抗体会表现出更多的批次间差异。
术语“匹配对”描述的是您在实验中用来检测单一抗原的单克隆抗体、多克隆抗体或两种抗体的混合物。这些抗体应该已被证明能够通过结合多个表位并作为有效的“捕获”和“检测”对发挥良好作用。
2. 灵敏度和检测范围
每种 ELISA 试剂盒都旨在检测不同的靶标，并具有独特的功能；它们并非普遍适用。了解您的 ELISA 试剂盒的灵敏度和特异性，以及每个步骤的精确增强，将提供准确可靠的标准曲线，显示您的靶标的测量值。
每个包装中都会包含针对每个目标量身定制的试剂和 ELISA 缓冲液。在测试开始时，请确保您了解每组参数，例如抗体类型、孵育时间、温度和报告系统。如果您事先熟悉这些参数，这将为您节省大量时间和烦恼。
3. 样本兼容性
了解特定 ELISA 试剂盒是否与样本（基质）的组成兼容（或不兼容）。试剂盒的性能通常使用各种基质进行评估，结果通常显示在说明书和其他支持材料中。确保您知道 ELISA 试剂盒在样本（尿液、组织培养、血浆、血清等）基质中的描述有多详尽。虽然这并不一定意味着试剂盒不起作用，但它将有助于了解您是否需要更多的验证试验来确定它在您感兴趣的基质中的表现如何。
4. 验证和质量控制
使用不同稀释度的对照样品进行一些测试以生成标准曲线，并充分利用您的试剂盒。保存您最好的样品，等您知道要使用的适当稀释度时再使用。了解要使用的样品和稀释度后，您可以最有效地安排您的板。确保您使用所有孔，并遵守试剂盒的说明。如果根据给出的信息需要额外的检测试剂，请添加它。
生成有价值且有意义的数据时，应力求准确和可重复。始终牢记 ELISA 协议，以确保一致性、最佳性能和精确结果。以下是需要考虑的实验协议：
1.在开始实验之前，让试剂盒试剂约 30 分钟达到室温或指定温度。
2.冷冻样品必须完全解冻，并且冻融循环次数应保持最少 - 不超过三次。
3.在实验期间和实验之间保持一致的环境条件，例如温度和湿度。
4.确保每件设备（例如读取器、洗板机和移液器）都经过校准。
5.使用足量的抗体。
6.使用新鲜配制的底物溶液，而不是在使用前将其储存数小时。
7.在测试期间，一致地处理样本并遵守相同的协议。
8.操作过程中目视检查吸头和孔，确保吸液、试剂添加和取出准确。液位应相同。
9.为了保证ELISA检测结果的准确性和可靠性，请勿混合不同批次或不同品牌的试剂。每个ELISA试剂盒的组装方式是使各个组件作为一个整体发挥作用，在检测之间进行大量混合可能会对结果产生负面影响，例如影响反应灵敏度、特异性等。
10.试剂使用后绝不可放回瓶中。
11.测试后，请将托盘关闭以防止孔变干。
1. 样品制备
在开始主要实验之前，请使用少量样本确定适当的稀释范围。您的样本必须与微量滴定板测试的格式兼容。所检查的生物标记物的数量总是会有所不同。
由于您要寻找符合样品标准曲线的数据，因此请使用试剂盒的说明作为指南。请注意，含有胆红素或其他干扰因素的样品会导致错误的发现。以下样品可与 ELISA 试剂盒一起使用：细胞裂解物、血清、唾液、血浆和细胞培养上清液。
2. 已知浓度的滴定标准品
已确定浓度的滴定 ELISA 标准对于任何 ELISA 都是必不可少的，因为它们使用户能够确定测试样品中的抗原浓度。为了创建标准曲线，通常留出一系列孔，并将已知量的纯化重组蛋白逐渐添加到孔中。
然后，用户可以从微孔板读数仪中获取已知蛋白质浓度的一组参考吸光度值，以便在这些孔与测试样品同时处理时与测试样品的吸光度值相匹配。
之后，您可以计算出标准曲线，以此来比较测试样本以确定所需蛋白质的浓度。用户稀释的准确度也可以通过标准曲线来验证。
3. 添加底物
孔中的酶量与ELISA 底物转化为产物的量直接相关。最常见的附着在抗体上的酶是碱性磷酸酶 (AP) 和辣根过氧化物酶 (HRP)。可以假设，针对每种酶定制的各种底物都可以产生荧光或显色产物。
此外，底物的敏感性各不相同，这可能会提高检测的总敏感性。在选择合适的底物和酶联抗体时，还必须考虑实验结束时读取 ELISA 板的设备。
4.检测与分析
确定 ELISA 灵敏度的一种传统方法是选择产生的信号至少比平均背景信号值高出两个或三个标准差的最低细胞因子浓度。
特定细胞因子和趋化因子蛋白存在于混合细胞因子环境中，例如受刺激的淋巴细胞培养上清液。因此，夹心 ELISA 可以量化这些蛋白质的生理相关量，这是由于检测抗体信号的酶介导扩增。
1. 结果计算
在 ELISA 过程中，通过将未知样本的值与标准曲线进行比较来确定未知样本的值。在样本稀释的情况下，稀释倍数需要乘以从标准曲线获得的浓度值。ELISA 样本应始终重复三次或两次，以提供具有足够数据的结果来进行统计验证。
对于每个标准、对照和样品，计算两次或三次测量的平均值，并扣除平均零标准光密度 (OD)。重复数据的变异系数 (CV) 不应超过 20%。
2. 标准曲线
使用计算机软件绘制平均吸光度与蛋白质浓度的关系，以创建标准曲线。确保遵循ELISA 测试协议建议的数据缩减技术。
将已知浓度的标准细胞因子蛋白溶液连续稀释，以创建标准曲线，并将其添加到夹心 ELISA 测试中。这些标准曲线也称为“校准曲线”。它们通常是通过将标准细胞因子蛋白浓度（通常以 ng 或 pg 细胞因子/ml 表示）与相应的重复平均 OD 值作图来制作的。
可以从标准曲线推断出疑似含有细胞因子的样本的浓度。ELISA 计算机软件程序可帮助完成此操作。为确保 OD 位于标准曲线的线性区域内，请确保对未知样本进行一系列稀释。研究人员可以选择对其数据应用各种曲线拟合分析，例如线性对数、对数对数或四参数转换，具体取决于所用的 ELISA 试剂类型。
如果没有软件，可以通过在线性尺度上绘制浓度对数与 OD 对数的图来线性化 ELISA 数据分析。可以使用回归分析来找到最佳拟合线。此过程将产生足够但不太准确的数据拟合。
3. 计算变异系数
变异系数 (CV) 描述的是标准差与平均值的比率，通常以百分比表示。CV 计算至关重要，因为它可能会揭示 ELISA 数据中的任何差异或错误。重复数据的变异系数 (CV) 不应超过 20%。较高的 CV 表示不准确和潜在错误较多。
每种 ELISA 都有某些缺点。首先，存在一个问题，即测试样品中存在多少目标蛋白质。如果数量过高或过低，微孔板读数器产生的吸光度读数可能分别超出或低于标准曲线的限值。因此，估计测试样品中蛋白质的精确数量将具有挑战性。
如果读数非常高，在将测试样品放入板孔之前先稀释它。根据稀释倍数，必须修改最终数字。DIY 试剂盒有时需要仔细优化抗体浓度以获得良好的信噪比。
如今 ELISA 技术已被改进以量化不同实验样本中的抗原水平。然而，它们背后的基本思想是相同的。在选择是否采用间接或夹心 ELISA 进行细胞因子检测时，待检测样本的复杂程度和抗原特异性抗体的可用性是至关重要的考虑因素。
当确定免疫反应的结果（例如确定样本中抗体的含量）时，可以使用间接 ELISA。当检查复杂样本时，如果分析物或靶抗原存在于混合样本中（如组织裂解物或培养上清液），夹心 ELISA 是最合适的方法。