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品质保证 · 通蔚试剂
021-54845833/15800441009品质保证 · 通蔚试剂
发布时间：2024-03-20 发布作者：上海通蔚生物
ELISA试剂盒具有灵敏度高、特异性好、操作简便、重复性好等优点，成为科研工作者和临床医生的重要工具。但ELISA操作要具备专业操作，在实验前能正确了解ELISA实验说明书，可以提高实验的准确性，避免实验假阳性发生。
ELISA试剂盒组成
现已开发了多种试剂盒来简化 ELISA 实验，并加速、简化和标准化每种 ELISA 的流程。现已开发试剂来提升特异性、可重复性和灵敏性，并最大程度降低成本。但没有预制试剂盒来评估某种特殊目的靶标时，实验者可以制备平板和必要的试剂。以下是有关一个 ELISA 实验所需的组分的概述。
一、样品制备
多个样品类型（如血液、尿液和裂解细胞）都常规通过 ELISA 进行分析。样品制备将取决于待解决的特殊问题。在血清中测定分泌蛋白（如细胞因子）的方法可直接使用，或者在某些情况下，至少需要清除步骤。在光谱的另一端，要检测翻译后修饰，这一般需要用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的缓冲液进行细胞裂解。样品制备会大大地改变实验和实验结果，因此这需要仔细考虑。
二、缓冲液
一个 ELISA 实验需要多种缓冲液。这些包括包被、封闭、洗涤、稀释、捕获和检测缓冲液。这些缓冲液的基本配方广泛提供，但多数为市售商品，可以节省时间，并为研究人员提升质控：
包被缓冲液 - 这种缓冲液可用来稳定某种抗原或抗体，从而促进抗原或抗体被吸收到孔的表面。抗原或包被抗体与塑料孔之间的相互作用会产生吸收和固定。这种被动结合受多种因素影响，包括塑料的表面化学性质、温度、包被缓冲液的 pH 值、抗原/抗体浓度和时间。常用的包被缓冲液包括磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)、碳酸氢钠或类似缓冲液，但应测试和优化这些条件。重要的是，包被缓冲液不应含有会竞争地结合抗原或抗体的蛋白。
封闭缓冲液 - 这种缓冲液能防止检测抗体非特异性地结合平板表面。这种缓冲液要么含有会封闭结合位点的蛋白，要么含有会防止结合的去垢剂。基于蛋白的封闭缓冲液仅在包被步骤之后才可以添加，因为溶液中的蛋白会被吸附到塑料上所有未结合位点上。像包被分析物或抗体一样，任何洗涤步骤都不会去除这些非特异性蛋白。封闭缓冲液需要优化，才能达到最大灵敏度和最低背景，并且不应含有会干扰检测抗体的组分。
洗涤缓冲液 - 这些缓冲液在各步骤之间用来去除所有未结合的物质，并需要在使用后完全去除。洗涤次数、每次洗涤的时长以及缓冲液中的去垢剂含量需要进行优化。
检测缓冲液 - 这些缓冲液含有被抗体-酶复合体催化的所需底物。这些底物多数对缓冲条件具有灵敏性，因此在考虑新的检测化学成份时，必须考虑裂解缓冲液和其他添加物，以减少检测分子出现非特异性裂解。
三、微孔板
可以用多种微孔板样式进行 ELISA，包括 96 孔微孔测试条、96-、384- 和 1536-孔板。
最常见的平板有平坦孔底，并且由聚苯乙烯制成。平板用多种方式处理，以产生疏水/亲水或特异性反应部分。
例如，使用蛋白 A 来更特异性地结合表面。选择优质平板和表面包被有利于降低背景，并增强结合。
检测化学成份通常会影响平板颜色选择：发色法为透明色，荧光法为黑色，比色法为白色。
四、ELISA 抗体
为 ELISA 选择的抗体应仔细选择，并验证使用。根据所选抗体能否高度特异性地结合目的抗原，可预测实验是否成功和结果是否可靠。除了特异性，选择的抗体还应对抗原具有较高的亲和力和亲合力。换言之，抗体应结合在一种物种的一个抗原上的表位（特异性），这种结合应快速而有力（亲和力），并且一旦结合，抗体-抗原复合体应稳定（亲合力）。
为夹心检测选择的抗体更复杂，因为每种抗体需要定向一个不同的表位。根据实验需要，夹心检测的 2 种抗体可以来源于不同物种或相同物种。
在 ELISA 中可使用单克隆抗体和多克隆抗体，但两者都能提供某些有利于实验者的优势。
在 ELISA 中使用单克隆抗体或多克隆抗体的优势
单克隆抗体：
对一个表位有特异性，因此它们不会干扰其他抗体结合抗原的其他区域
不太可能非特异性地结合其他抗原
可用于一个 ELISA 的所有步骤
作为非竞争性抗体匹配对的一部分，对夹心 ELISA 尤其有用
多克隆抗体：
可检测同一抗原上不同表位的抗体并集
可能会检测一个靶蛋白上的多个结合位点，因此可提供更稳定的信号
对于需要用某种酶（如 HRP 或 AP）标记的抗体，标记效率、批间变化和偶联后的一致性结合都是设计一个高质量实验需要处理的问题。
五、ELISA 对照
对照对确保每份样品产生的信号在生理学上都是准确的非常重要。可以合并使用一组对照来验证一个 ELISA 实验的有效性。有如下对照：
空白对照可用来提供背景信号参考，并确保读取值表示样品中的分析物浓度，而不是实验设置的人为结果。
阳性和阴性对照可用来比较分析物产生的信号。
加标对照可用来给出有关某种特殊样品基质中分析物发现程度的信息，从而表明检测性能。
六、微孔读板机
所选择的微孔读板机应匹配 ELISA 中使用的检测类型。比色反应的灵敏度最低，其次是化学发光和荧光反应。使用的检测类型应根据样品分析物数量以及是否需要放大和/或多重分析来决定。重要的是，用特定微孔读板机检测的动态范围和灵敏度应该还会影响检测方法的选择。
Elisa试剂盒方法分为竞争elisa法、夹心法elisa、直接elisa法和间接elisa法等。
4种elisa法介绍
一、直接 ELISA法
直接 ELISA 技术涉及将抗原固定在聚苯乙烯微孔板上，然后使用蛋白质（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA 或任何其他动物蛋白）封闭微孔板。然后，洗涤板并与一抗一起孵育。
在此测定中，一抗直接与底物（例如 HRP 或 AP）结合，导致颜色变化。由于过程中只涉及较少的步骤，直接 ELISA 是一种适用于实验室工作流程的快速技术，同时还消除了二抗交叉反应。但其缺点是反应灵敏度低、成本低。
直接ELISA法
二、间接 ELISA法
该技术的步骤与直接 ELISA 类似。唯一的区别是涉及额外的洗涤步骤以及该过程中使用的抗体类型。
间接 ELISA工作流程中 涉及两种类型的抗体：一抗和二抗。
首先添加一抗并洗涤，然后与标记的二抗一起孵育。
间接 ELISA 的优点是成本较低、更加灵敏和灵活。然而，由于二抗的存在，检测过程中存在交叉反应的可能性。
三、夹心ELISA法
在此测定中，抗原夹在两种抗体之间。这就是该测定被称为夹心 ELISA 的原因。该测定首先使用捕获抗体包被微孔板表面，用 BSA 封闭表面，然后向微孔板中添加抗原，持续约 90 分钟。
孵育步骤后，用缓冲液清洗板，然后与标记的二抗一起孵育。然后，添加底物来研究和测量反应信号。
尽管夹心 ELISA 具有最高的灵敏度，但其主要缺点是该过程所需的时间和费用。此外，寻找完美抗原抗体对的必要性也是该测定的限制。
夹心elisa法
四、竞争性 ELISA
该测定检测测试样品中抗原特异性抗体的存在。它涉及使用两种抗体：样品中存在的抗体和酶联抗体。它们在反应过程中竞争抗原。没有颜色代表阳性测试结果，而有颜色则代表阴性测试结果。
该测定法不能用于经过任何程度稀释的样品，并且灵敏度较低。然而，它有许多优点，例如需要较少的样品纯化、较小的变异性以及分析样品中的一系列抗原。
虽然不同类型 ELISA 的实验方案有所不同，但应考虑大多数检测中常见的步骤如下：
elisa流程图
板材涂层
大多数 ELISA 的第一步是将检测的第一个组分与测试板结合。这通常是通过被动吸附来完成的，这是一个非特异性过程，因此结果将取决于施加到板上的内容。如果应用含有抗原的样品，则结果是仍然需要选择性步骤的板，因为将结合各种抗原，而不仅仅是感兴趣的抗原。然而，如果应用纯化的抗原（如用于抗体检测的间接 ELISA 的情况）或捕获抗体（如夹心 ELISA 的情况），那么结果就是一块已经具有选择性特性的板。
根据检测的目标和性质，可以使用多种板类型，其中大多数是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，具有不同的结合特性。一些目标，包括高度糖基化的蛋白质、碳水化合物、DNA、脂质、短肽和蛋白质，在去垢剂存在下，不能很好地吸附。在这些情况下，建议使用经过处理以允许与表面共价连接的板。
孵化
将试剂添加到 ELISA 板后，必须对其进行孵育，以便有时间进行结合或反应。每次孵育的温度和持续时间将取决于测定步骤和所执行的操作。通常在 37 ° C下孵育 1 小时，例如在上样后。然而，诸如封闭之类的步骤可以在冰箱中进行过夜，并且检测期间的孵育通常在室温下进行更短的时间。
洗涤
洗板是应用测定的每个成分直至检测之间的重要步骤。清空孔中的溶液后，用缓冲液（通常是磷酸盐缓冲盐水-Tween 20 (PBST) ）清洗孔，以去除任何残留的未结合抗原、抗体或试剂。这可以使用多通道移液器手动完成或使用自动洗板机完成。清洗不充分可能会导致背景信号较高，而清洗过多可能会导致样品信号较低。不一致的洗涤可能会导致整个板的不一致，从而导致结果不可靠。
封闭
用蛋白质包被 ELISA 板后，通常需要进行封闭，以防止后续操作步骤中检测抗体的任何非特异性结合（图 2）。将与测定无关的混合蛋白质添加到板中并在板中孵育，占据任何可用的非特异性结合位点。常见的蛋白质封闭缓冲液选择包括脱脂奶粉、牛血清白蛋白 (BSA) 和酪蛋白。或者，非离子去污剂，如 Tween 20 或 Triton X-100，可用作封闭剂，但不能提供像蛋白质一样的永久封闭。无效的板封闭会导致背景噪音增加并降低测定的灵敏度和特异性。
封闭过程如何防止非特异性结合
抗体
实验抗体是大多数 ELISA 的基石，选择正确的抗体至关重要，尤其是在使用多种抗体的情况下。单克隆抗体和多克隆抗体都可以使用，每种抗体都有自己的优点和局限性。单克隆抗体具有较高的特异性，但成本较高。另一方面，多克隆抗体可以在多个结合位点结合靶标，从而放大信号并提高灵敏度。
使用二抗的方法增加了额外的步骤，延长了测定时间，增加了出错的机会，并且需要更多的优化来找到合适的相容抗体对。然而，使用多克隆二抗所带来的灵敏度增益可能使得这对于开发有效的测定是有价值的或必要的。
检测
无论使用哪种 ELISA 类型，都以检测步骤结束，最常见的是利用酶介导的可见颜色变化化学，然后可以使用紫外-可见分光光度法进行测量。将酶结合的抗原或抗体施加到测试孔中，如果其目标存在，它将结合。当酶的适当底物添加到板中时，它会引起颜色变化，颜色变化与孔内结合的靶标量成正比。辣根过氧化物酶 (HRP) 是一种常见的缀合物，与底物 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB) 配合使用，它会因 HRP 的反应而变成蓝色，然后在添加硫酸溶液时变成黄色，从而停止的反应。
然后可以使用酶标仪（添加终止液后的 TMB 为 450 nm）（一种紫外-可见分光光度计）确定每个孔的吸光度值，并进行校正和计算，例如减去平均空白根据测定设计进行孔值、技术重复的平均或与标准的比率计算。
一、防范措施
1.本试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断或治疗程序。
2. 试剂盒不得超过有效期使用。
3. 请勿混合不同批次的试剂。
4. 试剂盒的设计和测试旨在检测手册中所示的特定目标和样品。将此套件用于其他目的应由最终用户仔细验证。
二、安全守则
1.本试剂盒提供的终止液是酸性溶液。使用试剂时要小心，避免风险。
2. 所有生物材料均应按照当地法律法规作为潜在危险进行处理和丢弃。
3.出于安全考虑，实验中需要个人防护装备，如实验服、手套、手术口罩和护目镜。
在生物医学研究领域，ELISA试剂盒作为一种常用的实验工具，其使用说明书的正确利用对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。那么，如何有效利用ELISA试剂盒使用说明书呢？
首先，仔细阅读并全面理解说明书的内容是关键。用户应仔细研读说明书，确保对试剂盒的组成、试剂的用途、实验步骤、反应条件以及注意事项等有清晰的认识。这有助于用户更好地掌握实验的关键环节，避免在操作过程中出现错误或遗漏。
其次，遵循说明书中的操作步骤和注意事项至关重要。说明书中的操作步骤是经过精心设计和验证的，遵循这些步骤可以确保实验的准确性和可重复性。同时，说明书中的注意事项也是实验成功的关键，用户应严格按照要求进行操作，避免出现安全问题或实验失败的情况。
此外，当遇到实验问题或异常结果时，用户应及时查阅说明书中的故障排除部分。说明书中通常会提供一些常见问题的解决方案，用户可以根据这些建议进行排查和调整，从而快速解决问题并恢复实验的正常进行。
最后，用户还应关注说明书的更新与版本变化。随着科研技术的不断进步和试剂盒的不断优化，说明书的内容也可能会有所更新。因此，用户应定期查看说明书的最新版本，以便了解最新的实验方法和操作要求，确保实验的准确性和可靠性。
总之，有效利用ELISA试剂盒使用说明书是提升科研效率与准确性的重要途径。用户应仔细阅读、遵循说明书的要求，并及时查阅更新内容，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。
上述是elisa试剂盒说明书介绍，通过上述的介绍，大家对elisa有个简单认识。大家在购买的elisa试剂盒通常会自带说明书，在实验前可以仔细越多说明书，了解实验的注意事项和试剂存储方法。